Grupa Nanowarstw Makromolekuł Zakładu Inżynierii Nowych Materiałów

W ostatnich latach obserwuje się intensywny rozwój badań, których celem jest opracowanie strategii tworzenia ‘inteligentnych’ materiałów o przestrajalnych właściwościach fizykochemicznych, modulowanych przez zewnętrzny czynnik, taki jak światło, temperatura czy pH. Materiały takie znajdują wiele zastosowań biomedycznych, w produkcji selektywnych membran, sensorów lub systemów separujących do kontrolowanego uwalniania leków a także w medycynie regeneracyjnej. Inteligentne warstwy polimerowe są wykorzystywane jako termoprzełączalne podłoża dla hodowli arkuszy komórek (ang. cell sheet engineering), umożliwiające samorzutne odczepienie całego arkusza komórek, wywołane zmianą temperatury. Jedną z grup inteligentnych materiałów wzbudzających największe zainteresowanie stanowią termoczułe szczotki polimerowe, zbudowane ze ‘szczepionych do’ lub ‘szczepionych z’ powierzchni łańcuchów polimerowych, które gwałtownie zmieniają swoje właściwości pod wpływem niewielkich zmian temperatury. Ze względu na mechanizm termoprzełączalności, materiały te można podzielić na cztery grupy:

• termoprzełączalne polimery z dolną/górną krytyczną temperaturą rozpuszczania polimeru (LCTS/UCTS);
• termoprzełączalne polimery z pamięcią kształtu (ang. shape memory polymers SMP), w których mechanizm przejścia jest związany z przejściem w stan szklisty (T_g) lub topnieniem fazy krystalicznej (T_m);
• termoprzełączalne polimery ciekłokrystaliczne (przejście fazowe nematyk- ciecz izotropowa);
• termoprzełączalne polimery dynamiczne (ang. dynamers), zdolne do odwracalnego tworzenia wiązań kowalencyjnych. 

Spośród tych materiałów najczęściej do zastosowań biomedycznych wykorzystywane są szczotki polimerowe na bazie polimerów z LCST (Rys. 1), których powierzchnia zmienia charakter z hydrofilowego (w temperaturach T<LCTS) na hydrofobowy (T>LCTS), co wpływa na adsorpcję biomolekuł, która silnie zależy od zwilżalności podłoża.

Rysunek 1. Reakcja ‘inteligentnej’ szczotki polimerowej na zewnętrzny bodziec – przejście ze stanu hydrofilowego (a) do hydrofobowego (b)

Prawidłowy przebieg procesu tworzenia szczotek polimerowych jest weryfikowany za pomocą dwóch metod eksperymentalnych – spektroskopii fotoelektronów (XPS) i spektrometrii mas jonów wtórnych z analizatorem czasu przelotu (ToF-SIMS). Właściwości fizykochemiczne powstałych warstw analizowane są pomocą pomiaru kąta zwilżania (CA, zwilżalność, energia powierzchniowa), mikroskopii sił atomowych (AFM, topografia) oraz elipsometrii (grubość, współczynnik załamania).

W ramach omawianego projektu analizowano właściwości fizykochemiczne szczotek polimerowych, które wykazują zdolność do dalszej modyfikacji oraz warstw bionaśladowczych, z wbudowanym aminokwasem lub molekułami cholesterolu. Wykazano także silną zależność temperaturową właściwości fizykochemicznych warstw poli(4-winylopirydyny) (P4VP), polimeru uznawanego dotąd za jedynie pH-czuły, który wykorzystano następnie do stworzenia pokrycia na bazie kopolimeru, które wykazuje dwustopniową zmianę  właściwości fizykochemicznych w funkcji temperatury.

W pierwszym etapie badań przygotowano szczotki polimerowe zbudowane z poli(monometakrylanu pentaerytrytolu) PPM. Polimer ten w swej strukturze posiada grupy hydroksylowe, które nie tylko wykazują niską toksyczność lecz także dają unikalną możliwość chemicznej modyfikacji już utworzonej szczotki. Przeprowadzone eksperymenty pokazały, że pokrycia takie wykazują silne właściwości termoczułe oraz zdolność do adsorpcji protein silniejszą niż warstwa kontrolna, co jest wynikiem zaskakującym, gdyż warstwy z grupami hydroksylowymi klasyfikowane są zazwyczaj jako antyadsorpcyjne (ang. antifouling). Właściwości te mogą być znacząco modyfikowane poprzez zastąpienie nawet niewielkiej części grup hydroksylowych przez grupy estrowe kwasu etanowego (AE, OC(O)CH₃) lub piromelitowego (PE, OC(O)C₆H₂(COOH)₃). Subtelne zmiany w strukturze chemicznej badanego pokrycia zostały potwierdzone poprzez zastosowanie niezwykle czułej wielowymiarowej analizy głównych składników (PCA, ang. Principal Component Analysis) do jednoczesnej inspekcji natężeń wielu sygnałów ToF-SIMS (Rys. 2)

Rysunek 2. Wielowymiarowa analiza głównych składników (PCA) modyfikowanych szczotek PPM.

Modyfikacja grup hydroksylowych wpływa zarówno na przebieg temperaturowej zależności zwilżalności podłoża (Rys. 3), jak również na jego biokompatybilność (Rys. 3b).

Rysunek 3. Wpływ modyfikacji warstwy PPM na zwilżalność (a) i zdolność adsorpcji protein (b)

Efekt ten jest najsilniejszy dla warstw PPM-PE, dla których zdolność do adsorpcji białek wzrasta po modyfikacji dwukrotnie, zwiększa się także jej wrażliwość na zmianę temperatury.

Badano także inteligentne szczotki polimerowe na bazie poli(N-metakrylamidu) z L-leucyną wbudowaną w łańcuch boczny polimeru. Połączenie takie pozwala uzyskać biomimetyczne pokrycia o zadanych właściwościach fizykochemicznych, sterowanych poprzez wybór polimeru, i szerokim wachlarzu możliwych właściwości biologicznych, naśladujących zachowanie polimerów naturalnych, determinowanych wyborem aminokwasu. Metoda ta jest niezwykle interesująca, gdyż pozwala na tworzenie biomimetycznych pokryć na dowolnym materiale, w tym także na tworzywach sztucznych. Dodatkowo dzięki specyficznej budowie aminokwasów i ich usytuowaniu w szczotce polimerowej, materiały takie wykazują zachowanie ‘inteligentne’, czyli ich właściwości są wrażliwe na zewnętrzne bodźce. Sprawia to, że mogą one znaleźć szereg zastosowań biomedycznych, jako urządzenia diagnostyczne, układy do kontrolowanego dozowania leków, materiały bioaktywne i biokompatybilne.

Przeprowadzone eksperymenty pokazują po raz pierwszy silną termoczułość tego typu pokryć, która znacząco wzrasta dla wysokich wartości pH (Rys. 4a). Efekt ten może być związany z różnym powinowactwem do wody, znacząco obniżonym dla warstw w niskim pH, na skutek obecności dużej ilości sprotonowanych grup karboksylowych.

Rysunek 4. Właściwości inteligentnych pokryć biomimetycznych PMNL: zwilżalność (a), adsorpcja protein (b, lektyna soczewicy LcH i albuminy z surowicy bydlęcej BSA) i wysoka cytokompatybilność (c, specyficzna linia komórek ludzkich nerki HEK-23)

Testy biokompatybilności, przeprowadzone dla dwóch modelowych białek – albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) i lektyny soczewicy (LcH) wykazały silną zdolność do adsorpcji białek (Rys. 4b), co umożliwia ich potencjalne wykorzystanie do produkcji sztucznych przeciwciał (ang. ’plastic antibodies’) lub systemów izolujących komórki nowotworowe. Co więcej, jak pokazały eksperymenty wykonane z użyciem specyficznej linii komórek ludzkich nerki HEK-23 (ang. human embryo kidney), pokrycia PNML wykazują doskonałą cytokompatybilność. Już po 72 godzinach hodowli komórki zaczynają łączyć się i tworzyć monowarstwę (Rys. 4c).

Dodatkowym atutem szczotek PNML, zwiększającym wachlarz ich potencjalnych zastosowań, jest obecność w ich strukturze wolnych grup karboksylowych, które mogą posłużyć do dalszej modyfikacji warstw, w celu przesunięcia temperatury przejścia w kierunku temperatur fizjologicznych lub dołączenia biomolekuł. 

Naturalną kontynuacją omawianych badań było przygotowanie pokryć polimerowych z wbudowaną biomolekułą – cholesterolem. Cholesterol jest naturalnym lipidem występującym w organizmie człowieka, który wbrew powszechnej opinii pełni niezwykle ważną i pozytywną rolę, w błonach komórkowych, w układzie nerwowym, hormonalnym  i immunologicznym. Aby wykorzystać unikalne właściwości cholesterolu, takie jak chiralność, krystaliczność, amfifilowość czy biokompatybilność łączy się go z innymi materiałami, na przykład tworząc polimery, które znajdują zastosowanie w systemach kontrolowanego uwalniania leków, rusztowaniach do hodowli komórek jak również w optoelektronice i technologiach informatycznych.

Przygotowano szczotki polimerowe na bazie cholesterolu (PChMa) a następnie scharakteryzowano ich właściwości fizykochemiczne w funkcji temperatury. Pomiary kąta zwilżania wody wykazały powtarzalną zmianę zwilżalności warstwy temperaturach poniżej 30 ̊C (Rys. 5a), będącą konsekwencją wewnętrznej reorganizacji warstwy, widocznej także w zmianie topografii (Rys. 5b).

Rysunek 5. Zwilżalność (a) i chropowatość (rms, b) warstwy PChMa. Różne symbole w (a) odpowiadają kolejnym cyklom ogrzewania warstwy.

Ponieważ warstwy PChMa wykazują w temperaturach fizjologicznych właściwości hydrofilowe, sprawdzono możliwość ich wykorzystania do zastosowań biomedycznych. W tym celu użyto ich jako podłoży do hodowli dwóch linii komórkowych – komórek nowotworowych pęcherza moczowego (HCV29, rys. 6a) i komórek warstwy ziarnistej (rys. 6b).

Rysunek 6. Proliferacja komórek HCV29 (a, c) i komórek warstwy ziarnistej (b, d) na podłożu PChMa (a, b) i szkle (c, d).

Przeprowadzone eksperymenty pokazują cytokompatybilność warstw PChMa, która zależy od rodzaju badanych komórek – jest doskonała dla komórek nowotworowych pęcherza moczowego (Rys. 6a) i nieznacznie niższa dla komórek warstwy ziarnistej (Rys. 6b). Efekt ten jest najprawdopodobniej związany z różną zdolnością adhezyjną obu linii komórkowych, gdyż wykazują one porównywalny stopień proliferacji  na obu badanych podłożach.

Ponieważ badania AFM przeprowadzone w szerokim zakresie temperatur wskazywały na dodatkową reorganizację warstwy w wyższych temperaturach, aby uzyskać pełną informację o obserwowanych zmianach wykonano pomiary za pomocą skaningowej kalorymetrii różnicowej (DSC, 7a), dla niezwiązanych cząsteczek PChMA.

Zarejestrowane widmo DSC wskazuje na ciągłą zmianę struktury badanych makromolekuł, z widocznymi dwoma przejściami, zinterpretowanymi jako b-relaksacja w stanie szklistym dla niskich temperatur i zdecydowanie silniejsze przejście ze stanu szklistego w plastyczny dla wyższych temperatur.

Rysunek 7. Reorganizacja struktury makromolekuł PChMa (a, DSC) i zmiana nachylenia direktora w nematycznym ciekłym krysztale ZLI-4119 orientowanym warstwą PChMa (b, mikroskopia polaryzacyjna).

Zachowanie to wykorzystano do stworzenia warstwy orientującej ciekłe kryształy nematyczne. Warstwy orientujące znajdują szerokie zastosowanie do tworzenia wyświetlaczy ciekłokrystalicznych (LCD, ang. liquid crystal display). Uzyskiwane dzięki warstwom orientującym nachylenie direktora wykazuje zazwyczaj bardzo słabą zależność temperaturową. W nielicznych przypadkach orientacja direktora wykazuje nagłą zmianę w tzw. temperaturze zakotwiczenia (ang. anchoring transition temperature), zbliżonej do temperatury przemiany fazowej z fazy nematycznej do izotropowej.

W celu sprawdzenia wpływu warstwy PChMa na orientację nematycznego ciekłego kryształu ZLI-4119 wykonano pomiary za pomocą mikroskopii polaryzacyjnej (POM) i techniki PolScope, pozwalającej na tworzenie map  osi optycznej molekuł¹¹⁷. Badania te wykazały ciągłą zmianę nachylenia direktora w szerokim zakresie temperatur (ang. anchoring tuning, 7b).

Różnorodne właściwości warstw PChMa, umożliwiają ich zastosowanie zarówno w biomedycynie jak i nowoczesnej elektronice, czyniąc je niezwykle obiecującym materiałem, którego wartość znacząco podnosi fakt, iż pochodzi on ze źródeł odnawialnych.

Kolejnym badanym materiałem była poli(4-winylopirydyna) (P4VP). Polimer ten wykorzystywany jest powszechnie na przykład do tworzenia pokryć antybakteryjnych, systemów antykorozyjnych, czujników wilgotnośc czy ogniw słonecznych. Choć doskonale znane są pH-czułe właściwości warstw P4VP, nigdy dotąd nie sprawdzano jaki wpływ na ich zachowanie ma zmiana temperatury. Temu zagadnieniu poświęcony został kolejny etap badań. Przygotowane zostały warstwy P4VP, zarówno w formie szczotek, jak i cienkich warstw polimerowych utworzonych metodą odlewania na wirujący podkład (ang. spin-coating), których właściwości następnie szczegółowo scharakteryzowano.   

>Przeprowadzone badania wykazały wyraźny wpływ temperatury na zwilżalność warstw (rys. 8a, b), znacznie silniejszy dla szczotek polimerowych (rys. 8a), Efekt ten najprawdopodobniej związany z różną organizacją wewnętrzną molekuł w warstwach przygotowanych różnymi metodami.

Rysunek. 8. Zwilżalność i schematyczny układ molekuł szczotki (a) i cienkiej warstwy (b) P4VP dla pH = 7 (gwiazdki) i pH = 2 (trójkąty)

Fragmenty pirydynowe w P4VP mogą tworzyć wiązania wodorowe z wodą oraz oddziaływać miedzy sobą siłami van der Waalsa lub za pośrednictwem oddziaływań typu p-p w sposób, który silnie zależy od pH. Dlatego aby wyjaśnić mechanizm odpowiadający za właściwości termoczułe warstw P4VP, poddano je dodatkowej analizie w niskim pH (pH = 2), która wykazała w tym przypadku całkowity zanik termoczułości dla obu rodzajów warstw (trójkąty na Rys. 8a, b).  Wyniki te umożliwiły stworzenie modelu wyjaśniającego zachowanie warstw P4VP. Dla średnich i wysokich wartości pH obserwowana zmiana zwilżalności jest typowa dla układów z dolną krytyczną temperaturą rozpuszczania (LCST). Dla T<T_C dominują wiązania między azotem z P4VP a wodorem z wody, natomiast dla T>T_C, termodynamicznie korzystniejsze staja się wiązania polimer-polimer, które wymuszają przejście P4VP ze stanu hydrofilowego do hydrofobowego. Z kolei dla niskich wartości pH następuje protonowanie grup pirydylowych, które prowadzi do odpychania fragmentów pirydylowych i preferencyjnego tworzenia wiązań wodorowych z tlenem z wody.

Dla warstw P4VP w formie szczotek polimerowych, które wykazują silną termoczułość, przeprowadzono także test biokompatybilności, analizując adsorpcję BSA i fibrynogenu.

Rysunek 9. Adsorpcja albuminy z surowicy bydlęcej (BSA, a) i fibrynogenu (b) do inteligentnych warstw P4VP. Obrazy fluorescencyjne (a, b) i analiza ilościowa (c).

Dla obu protein zaobserwowano silną zależność stopnia adsorpcji od temperatury, która najprawdopodobniej jest związana ze zmianą konformacji szczotek P4VP, indukowaną przez zrywanie wiązań wodorowych pomiędzy grupami pirydylowymi i wodą.

Wyniki uzyskane dla warstw P4VP oraz dla szczotek polimerowych na bazie poli(metakrylanu eteru etylowego glikolu oligoetylenowego) (POEGMA), które wykazują znacznie słabszą zdolność do adsorpcji białek, stanowiły motywację do podjęcia próby stworzenia pokrycia łączącego ich właściwości, poprzez przygotowanie szczotek zbudowanych z kopolimerów P(4VP-OEGMA).

W pierwszym kroku sprawdzono właściwości pokryć przygotowanych na bazie kopolimerów o różnym stosunku merów P4VP i POEGMA. Przeprowadzone badania wykazały termoczułość wszystkich badanych warstw, jednakże charakter obserwowanych zmian silnie zależy od kompozycji kopolimeru (rys. 10). Dla kopolimeru symetrycznego (P(4VP-)OEGMA)3) oraz asymetrycznego z większą zawartością merów POEGMA (P(4VP-)OEGMA)4) po raz pierwszy zaobserwowano dwa przejścia, w temperaturach porównywalnych z T_C dla pokryć P4VP (14 ̊C) i POEGMA (26 ̊C). Efekt ten zanikał dla niskich wartości pH.

Rysunek 10. Zwilżalność warstw P(4VP-OEGMA) dla kopolimerów o różnym stosunku merów P4VP i POEGMA.

Podwójne przejście widoczne było także w zmianie topografii powierzchni, którą analizowano za pomocą mikroskopii sił atomowych AFM.

Ponieważ uzyskane wyniki wskazują na największą możliwość potencjalnych zastosowań pokryć na bazie kopolimeru symetrycznego, to właśnie je poddano dalszej analizie, pod kątem biokompatybilności. Analizowano adsorpcję BSA dla trzech różnych temperatur – poniżej pierwszego przejścia (10 ̊C), powyżej drugiego przejścia (32 ̊C) oraz pomiędzy nimi (20 ̊C) (Rys. 11).

Rysunek 11. Właściwości warstwy P(4VP-OEGMA): zwilżalność (a), topografia (b) i zdolność adsorpcji białek (BSA, c) dla różnych reżimów temperaturowych.

Przeprowadzone eksperymenty pokazały trójstopniową zmianę zdolności warstwy P(4VP-OEGMA) do adsorpcji protein. Poniżej temperatury pierwszego przejścia, czyli w obszarze gdzie oba polimery wykazują właściwości antyadsorpcyjne, pokrycie nie adsorbuje białek. Powyżej temperatury drugiego przejścia, gdzie oba polimery wykazują dużą zdolność adsorpcji, zarejestrowane natężenie fluorescencji, proporcjonalne do ilości zaadsorbowanych białek, jest maksymalne. Dla temperatur pośrednich, gdzie P4VP wykazuje zdolność adsorpcji białek a POEGMA ma właściwości antyadsorpcyjne, zaobserwować można pośrednie natężenie fluorescencji.

Wszystkie badane warstwy wykazały biokompatybilność, co potwierdza możliwość ich zastosowania w biomedycynie. Warstwy oparte na cholesterolu, mogą zostać wykorzystane także w elektronice, na przykład jako warstwy orientujące ciekłe kryształy w wyświetlaczach LCD.